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實驗技術|免疫組化成功指南(IHC)&常見問題匯總

瀏覽次數:317      日期:2019年07月29日 08:58

免疫組織化學又稱免疫細胞化學,是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應,對相應抗原進行定性、定位、定量測定的一項技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來,借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用,在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

 

免疫組化技術(IHC)是一種綜合定性、定位和定量;形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。常用于確認腫瘤或其他組織癌變的形態特征。在保持原組織成分、細胞特征以及結構的情況下,IHC利用抗體檢測和分析該組織細胞中的蛋白質表達。
 
IHC是一項具有挑戰性的應用技術,應用過程中常出現各種問題。本文旨在通過提供建議來幫助您改進IHC檢測,減少您的實驗優化過程,快速達到預期結果。
 
免疫組化步驟
 

△點擊放大圖片查看
 
 
·詳細步驟來一波·
確定抗體信息無誤,并準備好所需樣本切片后,將切片依次放到染色架上,置于200 mL,2%的APES-丙酮溶液中1 min,立即放入烘箱中60℃,15 min,避免脫片。
➥ 脫蠟水化
從烘箱中取出染色架,放入染色盒中脫蠟。
(注:脫蠟時長隨溫度和脫蠟劑使用次數而定,30min~1h)
將經過脫蠟的染色架取出,瀝干,依次放入無水乙醇的染色盒中。
放入3%的
H2O2中3min,以消除組織內源性過氧化物酶的活性。
放入pH7.4的PBS中靜置。
➥高壓抗原修復
高壓鍋中水浴至100℃,并將染色架放入其中。
(注:緩沖液加熱過程中為防止燒杯中進入大量水蒸汽,需將燒杯口用保鮮膜封住)
➥ 封閉
用10%非免疫山羊血清封閉切片上的組織,置于濕盒中室溫靜置30min。
一抗孵育
將封閉液甩去,加入用1%酪蛋白稀釋的一抗,4℃過夜。
將切片置于染色架中,放入PBST中洗滌四次。
➥ 二抗孵育 
切片上加入酪蛋白稀釋的二抗置于濕盒中37℃孵育1h。
將切片置于染色架中,放入PBST中洗滌四次。
➥三抗孵育
切片的組織上加入酪蛋白稀釋的三抗置于濕盒中37℃孵育1h。
將切片置于染色架中,放入PBST中洗滌三次。再放入PBS中洗滌二次。
➥DAB染色
切片的組織上加入DAB染色液,置于濕盒中室溫放置10-15 min。
(注意顯微鏡下觀察切片染色情況,染色到深黃且背景無明顯著色可進行下一步)
將切片置于染色架中,放入PBS中洗滌二次,每次5min。
➥ 蘇木素染色
切片的組織上加入蘇木素染色液,置于濕盒中室溫放置30min。

➥ 脫水封片
將染色架置于清水中洗滌浸泡30min,放入烘箱中烤干。
切片的組織上加入中性樹膠,并加上蓋玻片。 
➥ 顯微鏡觀察并拍照
選取合適視野進行拍照。
 

IHC常見問題及解決辦法

 
問題 原因 解決方案
邊緣效應  組織邊緣貼附不牢,邊緣組織松脫漂浮于液體中 APES/多聚賴氨酸處理玻片;組織切片盡量薄;盡量避免選用壞死較多的組織
試劑未充分覆蓋組織 滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織
非特異性染色體  抗體質量問題 使用質量有保證的抗體
抗體孵育時間長 減少孵育時間
抗體濃度過高 降低抗體濃度
一抗為多抗 使用單克隆抗體
內源性過氧化物酶及生物素 延長滅活時間
封閉不足 延長封閉時間
DAB孵育時間過久或濃度過高 按說明書配置試劑,鏡下控制反應時間
抗體孵育后洗滌不充分 每次孵育之后洗3~5次
實驗過程干片 及時滴加試劑
陰性結果  抗體濃度及質量 選擇有質量保證的抗體,先做預實驗摸索抗體使用濃度
抗原修復不足 摸索合適的抗原修復方式及修復時間
封閉時間過長 減少封閉時間
DAB孵育時間短 鏡下控制顯色時間
細胞通透不全,抗體未能進入細胞反應 選擇合適的通透劑及其反應時間
一抗二抗不匹配 選擇正確來源的二抗
脫片  玻片未處理好 玻片清洗干凈后用APES或多聚賴氨酸處理
切片厚薄不均勻 更換刀片;調整好切片機狀態
烤片時間或溫度不夠 60℃ , 2小時
組織自身問題 腫瘤壞死組織及骨組織本身易脫片
抗原修復時溫度迅速變化 抗原修復后讓其自然冷卻
染色弱  抗體濃度低,孵育時間短 提高抗體濃度,延長反應時間
試劑使用超過有效期 試劑定時更新
滴加試劑時殘余緩沖液過多使試劑稀釋 滴加試劑前盡量減少殘余液體
封閉過度 減少封閉時間
著色不均勻
切片厚度不一致 更換刀片;調整好切片機狀態
試劑配制未混勻使局部濃度不一致 試劑充分混勻后滴加
試劑未完全覆蓋組織 滴加試劑時讓試劑完全覆蓋組織
脫蠟不完全 更換脫蠟劑或延長脫蠟時間

 
華美IHC驗證圖示例

 
 
 
明明白白做實驗
善其事前利其器
普通問題常規避
優化成功沒問題
 
—END—
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